Prochází-li tok rovnoběžných monochromatických paprsků o určité zářivé energii (F0), homogení vrstvou délky (l), dochází k určité absorbci záření a z homogenní vrstvy vychází paprsek se sníženou zářivou energií (F).
Velikost absorpce záření je závislá na délce vrstvy (l) a na koncentraci absorbující složky (c). Vzájemný vztah mezi absorbcí záření, délkou vrstvy a koncentrací absorbující látky udává spojený Lambert – berův zákon, který můžeme matematicky vyjádřit jako A= e · c · l. Kde A – absorbance, c – koncentrace absorbující složky, l délka absorbující vrstvy a e – molární absorbční koeficient, který je charakteristický pro danou látku.
Lambert – Beerův zákon platí pouze v omezeném rozsahu (je zákonem limitním). Platí pouze za následujících podmínek:
- záření musí být monochromatické
- roztoky musejí být velmi zředěné ( c < 10-2 mol/l)
- absorbující prostředí nesmí podléhat žádným změnám
- v roztoku musí být jen jedna absorbující složka. Pokud je v roztoku přítomno více složek je absorbance sumou absorbancí jednotlivých složek.
Odchylky do L.B. zákona se projeví pokud vyneseme závislost absorbance na koncentraci ochylkou od lineární přímky směrem nahoru (konvexní tvar), dolů (konkávní tvar).
Závislost absorbace na koncentraci nazýváme kalibrační křivkou. V rozsahu zákona L.B. má tvar přímky vycházející z počátku. Z kalibrační křivky můžeme určit koncentraci látky ve zkoumaném roztoku. Pokud má kalibrační křivka lineární průběh můžeme k určení koncentrace látky určit výpočtem.
c(vz) = Avz/Ast · c st; kde c(vz) – koncentrace látky ve vzorku, c(st) koncentrace látky ve standardu, A(vz) absorbance vzorku, A(st) – absorbance standardu.
Pokud je v roztoku přítomna i jiná absorbující složka, pak protíná křivka osu y a absorbace je dána vztahem A = A0 + e · c · l; kde A0 je absorbace pozadí (další absorbující složky).
Další pojmy z elektronové absorbční spektrofotometrie
- Transmitance (propustnost) T – udává poměr mezi zářivým tokem prošlého prostředím ku zářivému toku dopadajícímu na absorbující prostředí nabývá hodnot od 0 do 1 nebo v procentech 0% – 100%.
- Absorptance a – udává tu část záření, které bylo absorbované
- Absorbance A – záporný dekadický logaritmust transmitance A = – log T